Μετά από 25 ημέρες στατικής επώασης στους 28°C, η λακκάση από το *Pleurotus ostreatus* NRC620 εμφάνισε την υψηλότερη δραστικότητα στο μέσο καλλιέργειας μυκήτων. Οι βέλτιστες τιμές pH και θερμοκρασίας για αυτό το ένζυμο ήταν 3,0 και 70°C, αντίστοιχα. Μετά από 2 ώρες επώασης στους 40°C και 50°C, η ενζυμική δραστικότητα διατήρησε το 68,33% και 59,61%, αντίστοιχα. Μετά από 2 ώρες επώασης σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού-φωσφορικού (pH 7,0), η ενζυμική δραστικότητα παρέμεινε στο 100%. Η προσθήκη 10 mM MgSO₄ και CuSO₄ αύξησε την ενζυμική δραστικότητα κατά περίπου 21% και 35%, αντίστοιχα, ενώ τα NaCl, MnCl₂, KCl και CaCl₂ ανέστειλαν την ενζυμική δραστικότητα. Χρησιμοποιώντας το ABTS ως υπόστρωμα, οι κινητικές παράμετροι (Km και Vmax) της λακκάσης *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ήταν 1,99 mM και 16.217 μmol min−1 L−1, αντίστοιχα. Η ενζυμική επεξεργασία δειγμάτων χυμού μήλου μείωσε σημαντικά τόσο το pH όσο και το ιξώδες, και αυτή η μείωση συσχετίστηκε με την αύξηση του χρόνου αποθήκευσης. Η επεξεργασία με λακκάση είχε ως αποτέλεσμα μια μικρή μείωση της συνολικής φαινολικής περιεκτικότητας του χυμού μήλου, αλλά δεν παρατηρήθηκε μείωση της αντιοξειδωτικής δράσης.
Τα τελευταία χρόνια, οι ερευνητές έχουν επικεντρωθεί στην εφαρμογή της πράσινης βιοτεχνολογίας στη βιομηχανία τροφίμων. Η λακκάση είναι ένα από τα πιο χρήσιμα ένζυμα στη βιομηχανία τροφίμων, βρίσκοντας εφαρμογές σε τομείς όπως η επεξεργασία χυμών, η αρτοποιία, η σταθεροποίηση κρασιών και η βελτίωση των οργανοληπτικών ιδιοτήτων των τροφίμων.1Πολλά ανώτερα φυτά και μικροοργανισμοί εκκρίνουν λακκάση,2και μύκητες όπως οι δευτερομύκητες, οι ασκομύκητες και οι βασιδιομύκητες μπορούν επίσης να παράγουν λακκάση.3Η λακκάση (EC 1.10.3.2) είναι μια μπλε οξειδάση που ανάγει το μοριακό οξυγόνο σε νερό χρησιμοποιώντας ένα σύστημα που αποτελείται από τρία διαφορετικά άτομα χαλκού, οξειδώνοντας έτσι διάφορες φαινολικές ενώσεις και αρωματικές αμίνες. Κατά την παραγωγή χυμών φρούτων και λαχανικών, η ενζυματική και η μη ενζυματική αμαύρωση είναι κρίσιμα ζητήματα.4Δεδομένου ότι αυτές οι ουσίες επηρεάζουν αρνητικά το χρώμα, τη γεύση και το άρωμα του χυμού, πρέπει να αφαιρεθούν.5
Από όλα τα φρούτα, τα μήλα είναι τα φρούτα που καταναλώνονται περισσότερο παγκοσμίως και στην Ευρωπαϊκή Ένωση. Το 2019, η παραγωγή μήλων κατέλαβε την τρίτη θέση παγκοσμίως, ξεπερνώντας τα 87 εκατομμύρια τόνους.6Τα μήλα περιέχουν πολυάριθμες φαινολικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων φλαβονοειδών και φαινολικών οξέων όπως το καφεϊκό οξύ και το χλωρογενικό οξύ.7Επειδή ο χυμός μήλου καταναλώνεται συνήθως στη διαυγή του μορφή, περίπου το 50% έως 90% των φαινολικών συστατικών χάνονται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας διήθησης.8Σήμερα, οι καταναλωτές τείνουν να επιλέγουν προϊόντα ελάχιστα επεξεργασμένα, όπως ο θολό χυμός μήλου με υψηλή περιεκτικότητα σε πολυφαινόλες. Ωστόσο, λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς του σε φαινόλες, αυτός ο τύπος χυμού μήλου είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος στον αποχρωματισμό και το σκούρο χρώμα.9Διάφορες τεχνολογίες, συμπεριλαμβανομένων μεθόδων θερμικής επεξεργασίας όπως η παστερίωση στους 60–90°C, χρησιμοποιούνται για τη μείωση ή την πρόληψη της σκουρόχρωμης εμφάνισης του χυμού μήλου.10Ωστόσο, σύμφωνα με έρευνα της Sauceda-Gálvez11, η θερμική επεξεργασία μπορεί να καταστρέψει τις πτητικές χημικές ουσίες και να επηρεάσει τις οργανοληπτικές ιδιότητες του χυμού μήλου. Εναλλακτικές λύσεις στις μεθόδους θερμικής επεξεργασίας περιλαμβάνουν το υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα, την υπεριώδη ακτινοβολία, τους υπερήχους, την υψηλή υδροστατική πίεση ή την ομογενοποίηση υψηλής πίεσης.12Η αποτελεσματικότητα αυτών των τεχνολογιών και η απόδοση κατάλληλων χυμών φρούτων εξαρτώνται από τις παραμέτρους που χρησιμοποιούνται και τα χαρακτηριστικά του προϊόντος. Η ευρεία χρήση τους περιορίζεται από το υψηλό κόστος, τις δυσμενείς επιπτώσεις στην ποιότητα ορισμένων τροφίμων ή την ανεπαρκή απενεργοποίηση των ενζύμων.13,14
Η λακκάση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σταθεροποίηση και τη διαύγαση του χυμού φρούτων.15Γκιόκμεν κ.ά.16Συνιστούν τη χρήση λακκάσης για τη διαύγαση χυμών φρούτων, επειδή απομακρύνει αποτελεσματικά τις φαινολικές ενώσεις μετατρέποντάς τες σε πολυμερή ή ολιγομερή που απομακρύνονται εύκολα από οποιαδήποτε μεμβράνη υπερδιήθησης, επιτρέποντας στον χυμό μήλου να διατηρεί σταθερό χρώμα και διαύγεια για έως και έξι εβδομάδες στους 50°C. Η καθαρισμένη λακκάση *Trichoderma* ακινητοποιήθηκε σε σφαιρίδια αλουμίνας και χρησιμοποιήθηκε για την επιλεκτική απομάκρυνση των δυσάρεστων ενώσεων που προκαλούνται από μικροβιακή μόλυνση του χυμού μήλου.17
Περίπου το 80-90% των πτητικών συστατικών του χυμού μήλου είναι εστέρες και αλδεΰδες, οι οποίες προσδίδουν ένα μοναδικό άρωμα στον χυμό.18Η λακκάση από το *Trametes versicolor* ακινητοποιήθηκε σε ένα φθηνό υπόστρωμα κατασκευασμένο από φυσικές ίνες από νεαρά κελύφη καρύδας για διαύγαση του χυμού μήλου.19Προηγούμενες μελέτες έχουν διερευνήσει τη σταθεροποίηση του χυμού μήλου (χρώμα και θολότητα) χρησιμοποιώντας μεθόδους χωρίς ένζυμα ή ακινητοποίησης ή σε συνδυασμό με υπερδιήθηση.5,19Ωστόσο, η επίδραση των μυκητιακών λακκασών στις φυσικοχημικές ιδιότητες του χυμού μήλου κατά την αποθήκευση παραμένει ασαφής. Επομένως, ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθούν πειραματικά οι αλλαγές στις φυσικοχημικές ιδιότητες, την περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις και την αντιοξειδωτική δράση του χυμού μήλου μετά από επεξεργασία με μυκητιακές λακκάσες και αποθήκευση στο ψυγείο για δύο εβδομάδες. Οι λακκάσες έχουν την ικανότητα να οξειδώνουν τις φαινολικές ενώσεις, γεγονός που τις καθιστά πολλά υποσχόμενες για χρήση σε διάφορες βιομηχανικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της διαύγασης του χυμού. Αυτή η μελέτη εξέτασε λακκάσες από το *Pleurotus ostreatus* NRC 620, εστιάζοντας στις ιδανικές συνθήκες για τη δράση και την αποτελεσματικότητά τους στη διαύγαση του χυμού. Ενώ η έρευνα για τα μανιτάρια στρειδιών (P. ostreatus NRC 620) είναι ακόμη περιορισμένη, προηγούμενες μελέτες έχουν εξετάσει ένζυμα από διάφορες μυκητιακές πηγές, όπως τα Trametes versicolor και Ganoderma lucidum. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η πιθανή εφαρμογή αυτού του ενζύμου στη βιομηχανία τροφίμων και να αναδειχθούν οι μοναδικές του ιδιότητες, ιδιαίτερα το ιδανικό pH και η θερμοκρασία του.
Το 2,2′-αζοοξυδις(3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ) (ABTS) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Καναδάς). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής καθαρότητας.
Το Κέντρο Συλλογής Μικροβιακών Καλλιεργειών του Εθνικού Κέντρου Ερευνών έλαβε το γνωστό στέλεχος μανιταριού στρειδιού NRC620. Μετά την υποκαλλιέργεια, αυτό το στέλεχος αποθηκεύτηκε σε κεκλιμένα άγαρ δεξτρόζης πατάτας στους 4°C. Η μέθοδος παρασκευής του εμβολίου ήταν η εξής: Πλήρως ανεπτυγμένο μυκήλιο 10 ημερών εμβολιάστηκε σε πλάκες άγαρ δεξτρόζης πατάτας και επωάστηκε στους 28°C. Μετά από 10 ημέρες, τρία μυκηλιακά μπλοκ διαμέτρου 12 mm αφαιρέθηκαν από το μέσο άγαρ χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο μεταλλικό διατρητήρα και τοποθετήθηκαν σε φιάλες Erlenmeyer των 250 mL με βαμβακερά βύσματα που περιείχαν 50 mL αποστειρωμένου μέσου καλλιέργειας (pH 5,0, όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τους Othman et al.20). Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 28°C για 18 ημέρες. Στη συνέχεια, οι καλλιέργειες διηθήθηκαν μέσω διηθητικού χαρτιού Whatman Νο. 1 και το υπερκείμενο υγρό που προέκυψε χρησίμευσε ως πηγή ενζύμου.
Η δραστικότητα της λακκάσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ABTS ως υπόστρωμα. Το μείγμα αντίδρασης (2 mL) περιείχε 500 μL ABTS 0,3 mM (διαλυμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου 0,1 M, pH 4,5) και την απαιτούμενη ποσότητα δείγματος ενζύμου αραιωμένου με απεσταγμένο νερό.21,22Λαμβάνοντας υπόψη ότι η λακκάση μπορεί να οξειδώσει το ABTS σε θερμοκρασία δωματίου (28 °C ± 2), η οξείδωση του ABTS προσδιορίστηκε μετρώντας την αύξηση της απορρόφησης στα 420 nm (ε420= 36.000 cm-1 M -1) χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV Agilent Carry-100. Απαιτήθηκε μία μονάδα δραστικότητας λακκάσης για την οξείδωση 1 μmol ABTS ανά λεπτό. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford χρησιμοποιώντας λευκωματίνη ορού βοοειδών ως εσωτερικό έλεγχο.23,24
Μετά την απόκτηση του ενζύμου από το στέλεχος NRC 620 του μανιταριού στρειδιών, η δραστικότητά του μετρήθηκε σε διαφορετικά διαστήματα καλλιέργειας για 25 ημέρες υπό στατικές συνθήκες στους 28 °C.
Για να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στη δραστικότητα της λακκάσης, διεξήχθησαν πειράματα σε εύρος θερμοκρασιών από 20 έως 90 °C. Πριν από την προσθήκη του ενζύμου και την έναρξη της αντίδρασης, το ρυθμιστικό διάλυμα (0,1 M κιτρικό νάτριο, pH 4,5) και το υπόστρωμα (ABTS) αναμίχθηκαν και επωάστηκαν για 5 λεπτά σε διάφορες θερμοκρασίες. Η θερμική σταθερότητα του ενζύμου αξιολογήθηκε με επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 0,05 M (pH 7,0) στους 40, 50, 60 και 70 °C για 2 ώρες, αντίστοιχα. Η υπολειμματική δραστικότητα αξιολογήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα ABTS.
Η επίδραση του pH στη δραστικότητα της λακκάσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ABTS ως υπόστρωμα σε ρυθμιστικά διαλύματα κιτρικού-φωσφορικού 0,1 M με εύρος pH από 2,5 έως 7,0. Το διάλυμα ενζύμου επωάστηκε στους 40°C για δύο ώρες σε ρυθμιστικά διαλύματα κιτρικού 0,1 M και Tris (pH 3, 4, 6 και 7) για να αξιολογηθεί η σταθερότητα του pH. Η υπολειμματική δραστικότητα με ABTS ως υπόστρωμα υπολογίστηκε μετά την επώαση.
Η λακκάση επωάστηκε για 10 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου (0,05 M, pH 7,0) που περιείχε διάφορα μεταλλικά ιόντα (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ και Mn2+) σε συγκεντρώσεις 2,5 mM και 10 mM, αντίστοιχα. Στη συνέχεια προστέθηκε το υπόστρωμα (ABTS) για να ξεκινήσει η αντίδραση και αξιολογήθηκε η σχετική δραστικότητα.
Η οξείδωση του ABTS από λακκάση σε διάφορες συγκεντρώσεις (0,025–3 mM) μετρήθηκε σε pH 4,5 για να προσδιοριστούν οι κινητικές παράμετροι (Vmax και Km).σταθερέςτης εξίσωσης Michaelis-Menten υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάγραμμα Lineweaver-Burk, το οποίο απεικονίζει το αντίστροφο του ρυθμού αντίδρασης ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος. Οι κινητικές σταθερές υπολογίστηκαν από το διάγραμμα Lineweaver-Burk χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism έκδοση 6.01.
Αφού πλύθηκαν καλά τα μήλα με νερό βρύσης, κόπηκαν στη μέση και στύβονταν χρησιμοποιώντας έναν πλήρως αυτόματο στύπτη μήλου Braun MP80 (κατασκευασμένο στη Γερμανία). Ο χυμός φιλτραρίστηκε μέσα από τέσσερα στρώματα τουλπάνι. Δεν προστέθηκαν ένζυμα στην ομάδα ελέγχου, ενώ προστέθηκε 2,0% λακκάση (η πιο αποτελεσματική συγκέντρωση που δοκιμάστηκε) σε φρεσκοπαρασκευασμένο χυμό μήλου, ο οποίος στη συνέχεια αποθηκεύτηκε στους 4°C για δύο εβδομάδες.
Η τιτλοδοτήσιμη οξύτητα (TA) και το pH προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο των Boulton et al.al.27Το pH κάθε δείγματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ψηφιακό πεχάμετρο (πεχάμετρο JENWAY 3510). Η τιτλοδοτούμενη οξύτητα (TA) υπολογίστηκε με βάση το μηλικό οξύ χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο.
Όπου V και C είναι ο όγκος (mL) και η συγκέντρωση (0,1 mol/L) του διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου που χρησιμοποιήθηκε στην ογκομέτρηση, αντίστοιχα. K είναι ο συντελεστής μετατροπής μηλικού οξέος, ίσος με 0,067, και W είναι η μάζα (g) του χυμού μήλου.
Τα συνολικά διαλυτά στερεά (Παρακράτηση ΦΠΑ) η περιεκτικότητα όλων των δειγμάτων χυμού προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα διαθλασίμετρο τσέπης PAL-1 (ATAGO, Τόκιο, Ιαπωνία). Μετά από κάθε μέτρηση, ο οπτικός φακός ξεπλύθηκε με απιονισμένο νερό και κάθε δείγμα χυμού μήλου δοκιμάστηκε τρεις φορές. Η τιμή για κάθε δείγμα υπολογίστηκε με βάση τον μέσο όρο των τριών μετρήσεων. Η μέση ± τυπική απόκλιση για κάθε δείγμα χυμού μήλου υπολογίστηκε επίσης με βάση τον μέσο όρο αυτών των αποτελεσμάτων.
Η ιξωδοελαστικότητα των δειγμάτων χυμού μήλου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα περιστροφικό ιξωδόμετρο (RV, Rheotest 2, Γερμανία). Το δείγμα τοποθετήθηκε μέσα στον κύλινδρο "S2" του ιξωδόμετρου. Το φαινομενικό ιξώδες αντιπροσωπεύτηκε από την κλίση της καμπύλης διατμητικής τάσης έναντι του ρυθμού διάτμησης, η οποία υπολογίστηκε από την διατμητική τάση και τις αντίστοιχες καμπύλες σε διάφορους ρυθμούς διάτμησης (από 1,00 έως 437,4 s⁻¹). Ο τύπος για τον υπολογισμό του φαινομενικού ιξώδους έχει ως εξής:
Όπου η είναι το φαινόμενο ιξώδες (cP), τ είναι η τάση διάτμησης (dyn/cm²), γ είναι ο ρυθμός διάτμησης (sec⁻¹) και το (τ) υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τις τιμές ροπής (α) και κυλίνδρου (Z) χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: τ = Z . α.
Ο δείκτης καφέτισης προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Meidav et al.αλ. 29Ένα δείγμα χυμού 10 ml φυγοκεντρήθηκε στις 2750 xg για 10 λεπτά. 5 ml του υπερκείμενου υγρού αναμίχθηκαν με 5 ml αιθανόλης 95%. Η απορρόφηση του μείγματος μετρήθηκε στα 420 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Shimadzu UV (UV-1601 PC).
Η συνολική φαινολική περιεκτικότητα (TPC) προσδιορίστηκε χρωματομετρικά χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu όπως περιγράφεται από τους Boulton et al.[27]]. Κατασκευάστηκε μια πρότυπη καμπύλη γαλλικού οξέος για συγκεντρώσεις από 0 έως 500 mg/L (r²= 0,997). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ισοδύναμα γαλλικού οξέος (mg GAE/mL).
Προσθέστε 125 μL απεσταγμένου νερού και 2850 μL διαλύματος FRAP σε 25 μL χυμού μήλου και αφήστε το μείγμα στο σκοτάδι για30λεπτά. Στη συνέχεια, μετρήστε την απορρόφηση στα 593 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Shimadzu UV (UV-1601 PC). Το αντιδραστήριο FRAP παρασκευάστηκε με ανάμειξη οξικού ρυθμιστικού διαλύματος 300 mM (pH 3,6), χλωριούχου σιδήρου(III) 20 mM και 10 mM 2,4,6-τρις(2-πυριδυλ)τριαζίνης (TPTZ) (διαλυμένης σε 40 mM HCl) σε αναλογία 10:1:1. Δημιουργήθηκε μια πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας Trolox ως πρότυπο (R²= 0,999), και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μM Trolox/mL.
Η αντιοξειδωτική δράση των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων χυμών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο DPPH για να αξιολογηθεί η ικανότητά τους να δεσμεύουν τις ελεύθερες ρίζες DPPH.31Δέκα μικρολίτρα χυμού αναμίχθηκαν με 1 ml διαλύματος DPPH (100 μM) σε μεθανόλη. Μετά από αντίδραση στο σκοτάδι για 30 λεπτά, η απορρόφηση του μείγματος μετρήθηκε στα 517 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Shimadzu UV (UV-1601 PC). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ισοδύναμα trolox (μM trolox/ml) με βάση μια καμπύλη βαθμονόμησης (R2= 0,990).
Τα δεδομένα που ελήφθησαν έδειξαν ότι η μέγιστη παραγωγή λακκάσης παρατηρήθηκε στα μανιτάρια πλευρώτους NRC 620 μέχρι το τέλος της 18ης ημέρας ζύμωσης, φτάνοντας σε δραστικότητα 1302 U/L. Αυτό χρησίμευσε ως βάση για τον προσδιορισμό του βέλτιστου χρόνου καλλιέργειας για την παραγωγή λακκάσης (Σχήμα 1). Αν και η παραγωγή ενζύμων αυξήθηκε με την αύξηση του χρόνου καλλιέργειας, ο ρυθμός αύξησης δεν ήταν άμεσα ανάλογος με τον χρόνο καλλιέργειας. μετά από 21 ημέρες, η δραστικότητα των ενζύμων είχε αυξηθεί μόνο κατά 90 U/L (σε 1390 U/L). Επομένως, οι 18 ημέρες επιλέχθηκαν τελικά ως ο βέλτιστος χρόνος καλλιέργειας για την εξισορρόπηση της απόδοσης του προϊόντος με τα οικονομικά οφέλη του αυξημένου χρόνου καλλιέργειας.
Επίδραση του χρόνου καλλιέργειας στην απόδοση λακκάσης στο Pleurotus ostreatus NRC 620. Τρία (12 mm) μυκηλιακά μπλοκ μυκήτων εμβολιάστηκαν σε 50 ml αποστειρωμένου μέσου και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν στους 28 °C για διαφορετικούς χρόνους.
Σε συμφωνία με άλλες μελέτες, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ιδανική περίοδος καλλιέργειας για την επίτευξη μέγιστης έκκρισης λακκάσης από τους μύκητες είναι πιθανό να είναι μεταξύ 7 και 36 ημερών.32Σύμφωνα με τους Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 παρήγαγε την υψηλότερη ποσότητα λακκάσης μέχρι το τέλος της ένατης ημέρας ζύμωσης, με ειδική δραστικότητα 1637 U/mg πρωτεΐνης. Επιπλέον, οι Othman et al.34διαπίστωσαν ότι το *Trichoderma harzianum* S7113 απέκκρινε μεγάλη ποσότητα λακκάσης την πέμπτη ημέρα της καλλιέργειας. Ο ρυθμός παραγωγής λακκάσης έφτασε σε μέγιστη δραστικότητα τη δέκατη τέταρτη ημέρα και στη συνέχεια μειώθηκε σταδιακά.34Αν και η έκκριση ενζύμων μπορεί επίσης να συμβεί κατά τη διάρκεια της κύριας φάσης ανάπτυξης, συνήθως κορυφώνεται κατά τη διάρκεια της ενδιάμεσης φάσης και πυροδοτείται από την κατανάλωση μιας πηγής άνθρακα ή αζώτου.34,35
Αν και η λακκάση από το Pleurotus ostreatus NRC 620 επέδειξε υψηλή δραστικότητα σε ένα ευρύ φάσμα θερμοκρασιών από 50°C έως 80°C, πλησιάζοντας την μέγιστη δραστικότητα (69-98%), η μέγιστη δραστικότητά της παρατηρήθηκε στους 70°C (Εικ. 2α). Εκτός αυτού του εύρους θερμοκρασιών, η ενζυμική δραστικότητα μειώθηκε στους περίπου 70°C. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το ένζυμο είναι ενεργό σε υψηλές θερμοκρασίες, πιθανώς επειδή η υψηλή θερμοκρασία αυξάνει την κινητική ενέργεια της αντίδρασης.
Επίδραση της θερμοκρασίας αντίδρασης (α) και του pH (β) στη δραστικότητα της λακκάσης στο *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Επιτεύχθηκαν θερμοκρασίες που κυμαίνονταν από 20 έως 90 °C με προεπώαση του μείγματος σε διαφορετικές θερμοκρασίες για 5 λεπτά πριν από την προσθήκη του ενζύμου και την έναρξη της αντίδρασης. Η επίδραση του pH στη δραστικότητα της λακκάσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ABTS ως υπόστρωμα σε διαλύματα που περιείχαν ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού-φωσφορικού 0,1 M σε εύρος pH από 2,5 έως 7,0.
Σύμφωνα με τους Ezike et al.al.33, η βέλτιστη θερμοκρασία για τη λακκάση *Trametes polyzona* WRF03 είναι 55 °C, η οποία είναι η ίδια με αυτή για το *Ganoderma lucidum*λακκάσης36και παρόμοια με τη βέλτιστη θερμοκρασία (50 °C) για το *Trametes polyzona* KU-RNW02737λακκάση . Μπαλντριάν38σημειώνει ότι, όπως και για άλλα ενζυμικά συστήματα που αποικοδομούν τη λιγνίνη, το ιδανικό εύρος θερμοκρασίας για τη λακκάση είναι μεταξύ 50 και 70 °C.
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ένζυμο εμφάνισε την υψηλότερη δραστικότητα σε pH 3,0, φτάνοντας το 94% δραστικότητας σε pH 3,5. Ωστόσο, παρέμεινε δραστικό σε ένα ευρύ φάσμα pH από 2,5 έως 7,0 (Σχήμα 2b). Επιπλέον, εμφάνισε υψηλότερη δραστικότητα σε όξινες συνθήκες σε σύγκριση με ουδέτερες ή αλκαλικές συνθήκες. Η δραστικότητά του παρέμεινε τουλάχιστον 77% σε εύρος pH από 2,5 έως 4,5, αλλά έφτασε μόνο περίπου το 38% σε pH 7,0. Το βέλτιστο pH για τη λακκάση από το *Trametes polyzona* WRF03 ήταν 4,533, το οποίο είναι το ίδιο με το pH για τις λακκάσες από τα *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 και *Trametes hirsuta* 41. Ωστόσο, σύμφωνα με τη μελέτη των Chairin et al.42, το βέλτιστο pH για τη λακκάση από το *Polymorpha f. sp.* WR710-1 είναι 2,2, ενώ το βέλτιστο pH για τη λακκάση από το *Polymorpha f. sp.* IBL-04 είναι 5,043. Η σύνδεση ανιόντων υδροξειδίου (αναστολέας λακκάσης) στα άτομα χαλκού της λακκάσης T2/T3 μπορεί να είναι η αιτία της μειωμένης δραστικότητας της λακκάσης υπό συνθήκες ουδέτερου ή αλκαλικού pH. Αυτό μπορεί να διαταράξει την εσωτερική μεταφορά ηλεκτρονίων από το κέντρο T1 στο κέντρο T2/T3, με αποτέλεσμαπεριοριστικόςη ενζυμική δραστηριότητα23,44
Με επώαση του ενζύμου σε διαφορετικές θερμοκρασίες, διαπιστώθηκε ότι τόσο ο χρόνος επώασης όσο και η θερμοκρασία επηρέασαν τη σταθερότητα του ενζύμου. Αξιοσημείωτα, η λακκάση από το *Trametes polyzona* NRC 620 παρουσίασε υψηλότερη σταθερότητα στους 40℃ και 50℃, διατηρώντας το 68,33% και 59,61% της αρχικής της δραστικότητας, αντίστοιχα, μετά από 120 λεπτά (Σχήμα 3α). Αντίθετα, υπό τις ίδιες συνθήκες (40℃ και 50℃, 120 λεπτά), η λακκάση από το *Trametes polyzona* WRF03 διατήρησε το 64,38% και 42,92% της δραστικότητάς της, αντίστοιχα.33Αντιθέτως, η αύξηση του χρόνου επώασης και της θερμοκρασίας μείωσε τη σταθερότητα της λακκάσης *Trametes polyzona* NRC 620. Μετά από επώαση στους 60℃ και 70℃ για 60 λεπτά, η δραστικότητά της μειώθηκε σε 39,24% και 1,72%, αντίστοιχα (Σχήμα 3α). Σύμφωνα με τα πειραματικά αποτελέσματα, η λακκάση από το *Trametes polyzona* WRF03 έδειξε υψηλότερη σταθερότητα στους 40 και 50℃ καθ' όλη τη διάρκεια της θερμικής επεξεργασίας.33Ομοίως, οι Lueangjaroenkit κ.ά.al.37και Chairin κ.ά.al.42ανέφεραν τη σταθερότητα των λακκασών από τα Trametes polyzona KURNW027 και Trametes polyzona WR710-1 στους 50 °C για 1 ώρα, αντίστοιχα. Ως χρήσιμος βιοκαταλύτης που εφαρμόζεται σε διάφορους βιοτεχνολογικούς τομείς, η λακκάση θα πρέπει να έχει καλή σταθερότητα και απόδοση σε ένα ευρύ φάσμα θερμοκρασιών.
Θερμοστατική σταθερότητα (α) και σταθερότητα pH (β) της λακκάσης από το *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Η θερμοστατική σταθερότητα αξιολογήθηκε με επώαση του ενζυμικού διαλύματος σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 0,05 M (pH 7,0) στους 40, 50, 60 και 70 °C για 2 ώρες, αντίστοιχα. Η σταθερότητα του pH αξιολογήθηκε με επώαση του ενζυμικού διαλύματος σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού άλατος 0,1 M και ρυθμιστικό διάλυμα Tris (pH 3, 4, 6 και 7) στους 40 °C για 2 ώρες. Η υπολειμματική δραστικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ABTS ως υπόστρωμα μετά την επώαση.
Για να προσδιορίσουμε τις βέλτιστες συνθήκες για τη χρήση και αποθήκευση των ενζύμων, διερευνήσαμε την επίδραση του pH στη σταθερότητα της λακκάσης. Η έκθεση σε διαφορετικές τιμές pH επηρέασε σημαντικά τη σταθερότητα της πρωτεϊνικής δομής, επηρεάζοντας έτσι τη σταθερότητα και τη δραστικότητα του μορίου του ενζύμου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ένζυμο ήταν λιγότερο σταθερό υπό όξινες συνθήκες, ενώ επέδειξε καλύτερη σταθερότητα σε υψηλότερες τιμές pH (ουδέτερες και αλκαλικές περιοχές). Σε τιμές pH 7,0, 6,0, 4,0 και 3,0, οι ρυθμοί κατακράτησης του ενζύμου μετά από 120 λεπτά ήταν περίπου 100%, 62,54%, 52,39% και 11,14%, αντίστοιχα (Εικ. 3b). Η λακκάση *Strombus multisus* WRF03 έδειξε υψηλότερη σταθερότητα σε ουδέτερες τιμές pH (5,5–6,5) και χαμηλότερη σταθερότητα σε όξινες τιμές pH (κάτω του 4,0). Μετά από 120 λεπτά σε τιμές pH 5,5, 6,0 και 6,5, τα ποσοστά κατακράτησης ενζύμων ήταν περίπου 82%, 100% και 93% αντίστοιχα.33Khairin et al.42σημείωσαν ότι η λακκάση από το Trametes polyzona WR710-1 ήταν σταθερή στην περιοχή pH από 6,0 έως 7,0, ενώ οι Sayed et al.45έδειξε ότι η λακκάση ήταν πιο σταθερή υπό συνθήκες ουδέτερου pH. Ωστόσο, η λακκάση από το Cerrena unicolor παρουσίασε επίσης σταθερότητα υπό αλκαλικές συνθήκες (pH 9,0)46Οι λακκάσες που μελετήθηκαν έδειξαν υψηλή σταθερότητα σε ένα ευρύ φάσμα pH. Αυτό μπορεί να είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό για βιομηχανικές εφαρμογές.
Δεδομένου ότι ορισμένα μεταλλικά ιόντα έχουν τόσο διεγερτικές όσο και ανασταλτικές επιδράσεις στην ενζυμική δραστηριότητα, οι επιδράσεις τους στην ενζυμική δραστηριότητα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη σε βιομηχανικές εφαρμογές. Αυτό είναι κρίσιμο επειδή τα μεταλλικά ιόντα είναι συνηθισμένοι περιβαλλοντικοί ρύποι που μπορούν να επηρεάσουν τη σταθερότητα και τη σύνθεση εξωκυτταρικών ενζύμων.47Για να διερευνήσουμε τις επιδράσεις πολλαπλών μεταλλικών ιόντων στη λακκάση από το *Pleurotus ostreatus* NRC 620, πραγματοποιήσαμε αντίστοιχα πειράματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, ανάλογα με τον τύπο του μετάλλου που χρησιμοποιήθηκε, η αύξηση της συγκέντρωσης μεταλλικών ιόντων από 2,5 mM σε 10 mM επηρέασε αρνητικά τη λειτουργία του ενζύμου. Για παράδειγμα,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, καιCu²⁺θα μπορούσε να διεγείρει και να ενεργοποιήσει τη δράση των ενζύμων, ενώΝα⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, καιΚ⁺θα μπορούσε να αναστείλει τη δράση του ενζύμου. Σε συγκέντρωση 10 mM, τα ιόντα Cu²⁺ και Mg²⁺ ήταν οι πιο ισχυροί ενεργοποιητές της δράσης της λακκάσης από το *Pleurotus ostreatus* NRC 620, παρέχοντας βαθμό ενεργοποίησης περίπου 34% και 20% αντίστοιχα. Ωστόσο, σε συγκέντρωση 10 mM, τα ιόντα Ca²⁺ ήταν ο πιο ισχυρός αναστολέας της λακκάσης, μειώνοντας τη δράση του ενζύμου κατά περίπου 60%.
Η επίδραση μεταλλικών ιόντων στη δραστικότητα της λακκάσης Pleurotus ostreatus NRC 620. Η λακκάση επωάστηκε για 10 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου (0,05 M, pH 7,0) που περιείχε διάφορα μεταλλικά ιόντα σε συγκεντρώσεις 2,5 mM και 10 mM. Η αντίδραση ξεκίνησε στη συνέχεια με την προσθήκη του υποστρώματος (ABTS), μετά την οποία μετρήθηκε η σχετική δραστικότητα.
Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με εκείνα άλλων συγγραφέων που διαπίστωσαν ότι τα Mg²⁺ και Cu²⁺ ενισχύουν τη δράση του *Trametes polyzona* WRF03³. Οι Castaño et al.⁴⁸ διαπίστωσαν ότι η λακκάση από το *Xylaria* sp. διεγείρεται σε κάποιο βαθμό από ιόντα χαλκού (Cu²⁺). Επιπλέον, οι Foroutanfar et al.⁴⁹ και Si et al.⁵⁰ διεξήγαγαν παρόμοιες μελέτες σε λακκάσες από το *Paraconiothyrium variabile* και το *Trametes pubescens*, αντίστοιχα. Η θέση σύνδεσης χαλκού τύπου II (T2) αυτού του ενζύμου μπορεί να κορεστεί με Cu²⁺ σε μια δεδομένη συγκέντρωση, γεγονός που μπορεί να εξηγήσει την διέγερση της δράσης της λακκάσης σε υψηλότερες συγκεντρώσεις Cu²⁺⁹. Δεδομένου ότι οι λακκάσες του μύκητα της λευκής σήψης είναι οξειδάσες που περιέχουν πολλαπλά άτομα χαλκού, οι επιδράσεις των ιόντων χαλκού στη δραστικότητα της λακκάσης είναι ποικίλες και κυμαίνονται από διεγερτικές και ανασταλτικές έως ουδέτερες.⁵¹ Αντίθετα, οι Zhou et al.[52]ανέφερε ότιCu²⁺ανέστειλε τη δράση της λακκάσης του υπόγειου τερμίτη της Ταϊβάν (Odontotermes formosanus). Ωστόσο, οι λακκάσες του Cerena sp. HYB07[53]και Clitocybe maxima[54]δεν επηρεάστηκαν από ιόντα χαλκού.
Η εξειδίκευση του υποστρώματος αναπαρίσταται από τις κινητικές του παραμέτρους (Km και Vmax). Όσο ισχυρότερη είναι η συγγένεια σύνδεσης του υποστρώματος με το ένζυμο, τόσο χαμηλότερη είναι η τιμή Km και τόσο υψηλότερη είναι η εξειδίκευση του υποστρώματος.3,21,55Οι κινητικές παράμετροι (Km και Vmax) της λακκάσης από το *Pleurotus ostreatus* NRC 620 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 6.0, σχεδιάζοντας το διάγραμμα Lineweaver-Burk (Σχήμα 5). Όταν χρησιμοποιήθηκε ABTS ως υπόστρωμα, τα αποτελέσματα ήταν 1,99 mM και 16217 μmol.λεπτά⁻¹ Λ⁻¹,αντίστοιχα. Elsayed et al.21ανέφεραν ότι οι τιμές Km για την οξείδωση του ABTS ήταν 0,1 mM και 0,064 mM, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας υψηλή συγγένεια των ισοενζύμων Lac A και Lac B για το ABTS. Επιπλέον, οι τιμές Vmax ήταν 0,182 μmolλεπτά⁻¹και 0,603 μmolλεπτά⁻¹, αντίστοιχα. Η τιμή Km που λήφθηκε ήταν χαμηλότερη από αυτή του Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM). Επιπλέον, η τιμή Vmax (1429 mmol min⁻¹) ήταν επίσηςχαμηλότεροςόταν χρησιμοποιείται ABTS ως υπόστρωμα.33 Ομοίως, οι τιμές Km των συγκεντρώσεων λακκάσης Lentinus squarrosulus MR13 και Trametes sp. AH28-2 ήταν 0,0714 mM και 0,025 mM, αντίστοιχα, και οι τιμές Vmax ήταν 0,0091 mM min−1 και 0,67 mM min−1 mg−1 (σε σχέση με το ABTS)., αντίστοιχα.56,57
Διερευνήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης ABTS στη δραστικότητα της λακκάσης από το *Pleurotus ostreatus* NRC 620 και απεικονίστηκε ένα διάγραμμα Lineweaver-Burk του αντίστροφου της αρχικής ταχύτητας αντίδρασης ως προς τη συγκέντρωση ABTS. Η αντίδραση οξείδωσης του ABTS με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,025–3,0 mM) λακκάσης μετρήθηκε σε pH 4,5 για να προσδιοριστούν οι κινητικές παράμετροι (Vmax και Km). Οι κινητικές σταθερές Michaelis-Menten υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το διάγραμμα Lineweaver-Burk του αντίστροφου της ταχύτητας αντίδρασης ως προς τη συγκέντρωση του υποστρώματος. Οι κινητικές σταθερές υπολογίστηκαν από το διάγραμμα Lineweaver-Burk χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 6.01.
Τα παραδοσιακά ένζυμα διαύγασης, όπως οι πηκτινάσες, υδρολύουν τις πηκτινικές ουσίες, μειώνοντας το ιξώδες και τη θολότητα. Διασπούν αποτελεσματικά τους δομικούς πολυσακχαρίτες και συχνά χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με άλλα ένζυμα, όπως οι κυτταρινάσες και οι ημικυτταρινάσες, για τη βελτίωση της απόδοσης και της διαύγειας. Ωστόσο, οι πηκτινάσες δεν στοχεύουν ειδικά τις φαινολικές ενώσεις, οι οποίες είναι οι κύριοι παράγοντες που συμβάλλουν στη θολότητα και την οξειδωτική αμαύρωση, ιδιαίτερα σε χυμούς όπως ο χυμός μήλου και σταφυλιού.58Αντιθέτως, οι λακκάσες καταλύουν την οξείδωση των φαινολικών ενώσεων, πολυμερίζοντάς τες σε μεγαλύτερα, αδιάλυτα μόρια που μπορούν να απομακρυνθούν με καθίζηση ή διήθηση. Αυτός ο μηχανισμός όχι μόνο βελτιώνει τη διαύγεια, αλλά και παρατείνει τη διάρκεια ζωής του χυμού μειώνοντας την πιθανότητα οξειδωτικού μαυρίσματος που προκαλείται από τις φαινολικές ενώσεις. Επιπλέον, οι διαδικασίες διαύγασης με βάση τη λακκάση μπορούν να πραγματοποιηθούν υπό ήπιες συνθήκες επεξεργασίας (pH 3,5–5,5, θερμοκρασία 25–40 °C), καθιστώντας τες κατάλληλες για ευαίσθητους χυμούς χωρίς να διακυβεύονται οι θρεπτικές ή οργανοληπτικές τους ιδιότητες.59Μελέτες έχουν δείξει ότι η επεξεργασία με πηκτινάση μπορεί να διαυγάσει τον χυμό σε 1-2 ώρες, ενώ η επεξεργασία με λακκάση συνήθως απαιτεί μεγαλύτερο χρόνο αντίδρασης (3-6 ώρες) για την πλήρη μείωση των φαινολικών ενώσεων. Ωστόσο, αυτή η διαδικασία μπορεί να βελτιστοποιηθεί με ακινητοποίηση του ενζύμου ή με συνδυασμό λακκάσης με μεθόδους μηχανικής διαύγασης.60Σε αυτή τη μελέτη, η ενζυμική ανάλυση του ακατέργαστου εκχυλίσματος αποκάλυψε σημαντικές δραστικότητες λακκάσης και α-αμυλάσης, ενώ οι δραστικότητες πηκτινάσης και ξυλανάσης ήταν εξαιρετικά χαμηλές και δεν ανιχνεύθηκε δραστικότητα κυτταρινάσης. Επομένως, η μείωση της θολότητας και της φαινολικής περιεκτικότητας οφειλόταν κυρίως στη δράση της λακκάσης, ενώ η αλλαγή στο ιξώδες θα μπορούσε να οφείλεται εν μέρει στη δράση της αμυλάσης.
Ο Πίνακας 1 δείχνει τις φυσικοχημικές παραμέτρους φρεσκοστυμμένου χυμού μήλου και δειγμάτων που έχουν υποστεί επεξεργασία με λακκάση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απόδοση φρεσκοστυμμένου χυμού μήλου (71,59%) ήταν χαμηλότερη από αυτή των δειγμάτων που είχαν υποστεί επεξεργασία με λακκάση (87,34%). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με τα ευρήματα των Pilnik και Orange.61, οι οποίοι υπέδειξαν ότι η χρήση ενζύμων στην επεξεργασία φρούτων μπορεί να αυξήσει την απόδοση του χυμού, να βελτιώσει τη διήθηση και να λάβει υψηλής ποιότητας, διαυγή χυμό για συμπύκνωση. Η αύξηση της απόδοσης του χυμού οφείλεται κυρίως στην αύξηση της περιεκτικότητας σε διαλυτά σάκχαρα στον χυμό. Κατά την ενζυμική υδρόλυση των φρούτων, η μεσόγλοια και η πηκτίνη στα κυτταρικά τοιχώματα του προϊόντος καταστρέφονται και μετατρέπονται σε διαλυτές ουσίες όπως ουδέτερα σάκχαρα και οξέα.62.Η τιμή του pH του χυμού μήλου που υποβλήθηκε σε ένζυμο ήταν σημαντικά χαμηλότερη από αυτή της ομάδας ελέγχου (P < 0,05) και η τιμή του pH και των δύο ομάδων αυξήθηκε σημαντικά κατά την αποθήκευση (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με εκείνα των Mark et al.63, οι οποίοι σημείωσαν ότι το pH του χυμού φρούτων κάσιους μειώθηκε μετά την αποθήκευση μετά από θερμική επεξεργασία. Η αποικοδόμηση της πηκτίνης και ο σχηματισμός γαλακτουρονικού οξέος μετά την ενζυμική επεξεργασία μπορεί να ευθύνονται για την αύξηση του pH κατά την αποθήκευση. Το pH των δειγμάτων που υποβλήθηκαν σε ένζυμο παρέμεινε μεταξύ 4,05 και 4,31 καθ' όλη τη διάρκεια της αποθήκευσης, ενώ το pH του μη επεξεργασμένου χυμού μήλου κυμάνθηκε μεταξύ 4,12 και 4,33.
Η συνολική οξύτητα (TA) τόσο των μη επεξεργασμένων όσο και των επεξεργασμένων με λακκάση δειγμάτων παρουσίασε φθίνουσα τάση με την αύξηση του χρόνου αποθήκευσης (Πίνακας 1). Η μείωση της οξύτητας αποδόθηκε στη μετατροπή των οργανικών οξέων σε υδατάνθρακες ή σε ενζυματικές αντιδράσεις, καθώς και στην οξείδωση κατά την αποθήκευση του χυμού.64Η συνολική οξύτητα του χυμού μήλου ελέγχου και των δειγμάτων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένζυμα ήταν χαμηλότερη από αυτή άλλων χυμών (χυμός φράουλας 0,9%, χυμός δαμάσκηνου 2,2%, χυμός κουμκουάτ 1,0%, χυμός βερίκοκου 2,4%, χυμός πορτοκαλιού 0,8%), αλλά παρόμοια με αυτή άλλων χυμών (π.χ. χυμός αχλαδιού 0,3%).62Αυτές οι διαφορές στον ακατέργαστο φρεσκοστυμμένο χυμό μήλου μπορεί να οφείλονται σε διάφορους παράγοντες όπως οι συνθήκες καλλιέργειας, οι γενετικοί παράγοντες, το επίπεδο ωριμότητας και οι μέθοδοι επεξεργασίας.65Η μείωση της συνολικής οξύτητας του χυμού μήλου ελέγχου και του χυμού μήλου που έχει υποστεί επεξεργασία με λακκάση είναι σύμφωνη με τα αποτελέσματα που παρουσίασαν οι Singh et al.66σχετικά με τη μείωση της συνολικής οξύτητας του χυμού μήλου Jin Nuo μετά από 74 ημέρες αποθήκευσης. Από την άλλη πλευρά, οι Oshmiansky και Wojdylo67δεν διαπίστωσαν σημαντικές αλλαγές στην οξύτητα του χυμού μήλου κατά τη μελέτη της επίδρασης των παραδοσιακών μεθόδων διαύγασης.
Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 δείχνουν ότι η τιμή των συνολικών διαλυτών στερεών (TSS) του χυμού μήλου που είχε υποστεί επεξεργασία με λακκάση ήταν υψηλότερη από αυτή του μη επεξεργασμένου δείγματος. Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με τις δημοσιευμένες μελέτες.. 68Επιπλέον, ο Πίνακας 1 δείχνει ότι η τιμή TSS της ομάδας ελέγχου χυμού μήλου ήταν 9,58 στο αρχικό χρονικό σημείο και έφτασε το 11,05 στο τέλος της περιόδου αποθήκευσης. Αυτές οι τιμές είναι χαμηλότερες από τις τιμές TSS του φρέσκου χυμού μήλου που αναφέρθηκαν από τους Hamid et al.. 69(11,2 και 11,80, αντίστοιχα). Η τιμή TSS των δειγμάτων χυμού μήλου που είχαν υποστεί επεξεργασία με λακκάση αυξήθηκε σημαντικά, ξεκινώντας από 11,23 και φτάνοντας στο 12,93 μετά από δύο εβδομάδες αποθήκευσης στους 4°C (Πίνακας 1). Παρόμοια αύξηση στην TSS κατά την αποθήκευση παρατηρήθηκε επίσης σε εσπεριδοειδή, λεμόνια και γλυκά πορτοκάλια. Η αύξηση των συνολικών διαλυτών στερεών (TSS) κατά την αποθήκευση μπορεί να οφείλεται στην υδρόλυση πολυσακχαριτών (άμυλο) σε μονοσακχαρίτες (σάκχαρα), στην αύξηση της συγκέντρωσης λόγω αφυδάτωσης του χυμού και στην αποικοδόμηση της πηκτίνης στον χυμό σε διαλυτά στερεά. Η αύξηση των συνολικών διαλυτών στερεών (TSS) πιθανότατα οφείλεται στην αύξηση των διαλυτών σακχάρων, τα οποία μπορεί να σχηματίζονται με τη μετατροπή της πηκτίνης ή της κυτταρίνης σε διαλυτά σάκχαρα από την πηκτίνη ή την κυτταρινάση, αντίστοιχα, ή με την υδρόλυση του αμύλου σε σάκχαρα, όπως αναφέρθηκε από τους Hamed et al.69.Η επίδραση της λακκάσης στις ιδιότητες του χυμού μήλου μπορεί να παρατηρηθεί οπτικά, καθώς ο χυμός μήλου που έχει υποστεί επεξεργασία με λακκάση παρουσιάζει καλύτερη ρευστότητα και χαμηλότερο ιξώδες από τον μη επεξεργασμένο χυμό. Αυτή η παρατήρηση καταγράφεται στον Πίνακα 1. Το ιξώδες του δείγματος που έχει υποστεί επεξεργασία με ένζυμα ήταν 1,87 cP, ενώ το ιξώδες του δείγματος ελέγχου ήταν 2,95 cP. Αυτή η σημαντική μείωση του ιξώδους πιθανότατα οφείλεται στην υψηλότερη ικανότητα συγκράτησης νερού των ουσιών που μοιάζουν με πηκτίνη και στον σχηματισμό μιας συνεκτικής δομής δικτύου.
Σε αυτήν τη μελέτη, η επίδραση της λακκάσης στον δείκτη καφέτισης (BI) του χυμού μήλου διερευνήθηκε μετρώντας την απορρόφηση στα 420 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Κατά την αποθήκευση, ο BI των δειγμάτων χυμού μήλου τόσο στις ομάδες που υποβλήθηκαν σε αγωγή όσο και στις ομάδες που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή έδειξε σταδιακή αυξανόμενη τάση. Ο BI αντανακλά τον βαθμό καφέτισης και μπορεί να χρησιμεύσει ωςένα σημαντικόδείκτης ενζυματικών και μη ενζυματικών αντιδράσεων καφέσης. Η απορρόφηση αυξήθηκε σημαντικά κατά την αποθήκευση (P < 0,05). Στο τέλος της αποθήκευσης, ηA420Η τιμή των δειγμάτων χυμού μήλου στις ομάδες ελέγχου και ένζυμης αγωγής αυξήθηκε κατά περίπου 217% και 121% αντίστοιχα (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενζυμική αγωγή μπορεί να μειώσει αποτελεσματικά τον βαθμό μαυρίσματος κατά περίπου 56%. Τα αποτελέσματα των Bezerra et al.[19]] συμφωνούν με τα αποτελέσματά μας. Χρησιμοποίησαν ίνες λακκάσης-γλουταραλδεΰδης-καρύδας για να διαυγάσουν τον χυμό μήλου, μειώνοντας το αρχικό του χρώμα κατά 61%.
Αν και οι πολυφαινόλες στους χυμούς φρούτων έχουν θετικές θρεπτικές και θεραπευτικές επιδράσεις στο ανθρώπινο σώμα, μπορούν επίσης να αντιδράσουν με πρωτεΐνες, προκαλώντας θολότητα, καθίζηση ή θολερότητα του χυμού, αλλοιώνοντας έτσι τη γεύση και το άρωμα του προϊόντος και μειώνοντας τη διάρκεια ζωής του.71Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η ασφαλής μείωση της περιεκτικότητας σε φαινολικές ενώσεις του χυμού μήλου χρησιμοποιώντας λακκάση από το Pleurotus ostreatus NRC 620. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 δείχνουν ότι η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις του χυμού μήλου που είχε υποστεί επεξεργασία με λακκάση μειώθηκε σημαντικά πριν από την αποθήκευση στους 4 °C. Επιπλέον, η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις μειώθηκε επίσης κατά την αποθήκευση και στα δύο δείγματα που μελετήθηκαν (Πίνακας 1). Έρευνα των Sandri et al.72έδειξε ότι ο χυμός μήλου που έχει υποστεί επεξεργασία με ένζυμα μπορεί να διατηρήσει την αντιοξειδωτική του δράση και την περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις. Ωστόσο, τα αποτελέσματα μιας μελέτης των Lettera et al.73δείχνουν ότι η επεξεργασία χυμού πορτοκαλιού με μυκητιακή λακκάση μπορεί να μειώσει την περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις έως και 45%.
Έχει αποδειχθεί ότι οι φαινολικές ενώσεις έχουν ιδιότητες όπως η δέσμευση ελεύθερων ριζών, η αναγωγή και η απόσβεση του οξυγόνου σε μονήρη μορφή, η μεταφορά ατόμων υδρογόνου και η δωρεά ηλεκτρονίων σε ελεύθερες ρίζες, καθιστώντας τες ισχυρά αντιοξειδωτικά.74Συνεπώς, σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι που βασίζονται στο DPPH και στο FRAP για την αξιολόγηση της επίδρασης της λακκάσης στην αντιοξειδωτική δράση του χυμού μήλου που φυλάχθηκε σε ψυγείο για 14 ημέρες (Πίνακας 2). Και οι δύο μέθοδοι έδειξαν αύξηση της αντιοξειδωτικής δράσης κατά την αποθήκευση, η οποία μπορεί να οφείλεται στην αύξηση των ελεύθερων φαινολικών ενώσεων ή στον σχηματισμό προϊόντων αντίδρασης Maillard (MRPs), με τα προϊόντα αντίδρασης Maillard να είναι πιθανώς η αιτία της αύξησης της αντιοξειδωτικής δράσης.75Οι μη ενζυμικές αντιδράσεις καφέτισης (συμπεριλαμβανομένης της αποικοδόμησης ασκορβικού οξέος, των αντιδράσεων Maillard και της καταλυόμενης από οξύ αποικοδόμησης σακχάρων) παράγουν καφέ χρωστικές (μελανοϊδίνες). Ενδιάμεσα προϊόντα αποικοδόμησης ασκορβικού οξέος και προϊόντα αποικοδόμησης σακχάρων (όπως καρβονυλικές ενώσεις) μπορούν να αντιδράσουν με αμινοξέα μέσω αντιδράσεων Maillard.76Αν και το μαύρισμα των φρούτων και των λαχανικών κατά την αποθήκευση έχει μελετηθεί εκτενώς, η κατανόησή μας για αυτές τις αντιδράσεις παραμένει περιορισμένη.77Σε σύγκριση με τη μέθοδο FRAP, ο χυμός μήλου που είχε υποστεί επεξεργασία με λακκάση έδειξε σημαντικά χαμηλότερη αντιοξειδωτική δράση με τη μέθοδο DPPH (Πίνακας 2) και η αντιοξειδωτική δράση όλων των δειγμάτων αυξήθηκε σημαντικά με την αύξηση του χρόνου αποθήκευσης. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής δράσης, επειδή οι αρχές τους διαφέρουν. Η μέθοδος DPPH μετρά την ικανότητα εξουδετέρωσης των ελεύθερων ριζών, ενώ η μέθοδος FRAP μετρά την ικανότητα μείωσης των ιόντων σιδήρου. Επομένως, συνιστάται η χρήση πολλαπλών μεθόδων για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής δράσης, ώστε να κατανοηθεί καλύτερα η αντιοξειδωτική δράση των μελετηθέντων δειγμάτων.78
Ένα από τα βασικά ευρήματα αυτής της μελέτης είναι ότι η λακκάση *Pleurotus ostreatus* NRC 620 παρουσιάζει βέλτιστη δραστικότητα στους 70°C και pH 3,0. Σε σύγκριση με άλλες μυκητιακές λακκάσες που χρησιμοποιούνται συνήθως για τη διαύγαση χυμών, όπως οι λακκάσες *Trametes versicolor* και *Ganoderma lucidum*, η *P. ostreatus* NRC 620 παρουσιάζει υψηλότερη θερμική σταθερότητα και πιο όξινο pH. Οι λακκάσες από *Trametes versicolor* και *Ganoderma lucidum* συνήθως εμφανίζουν βέλτιστη δραστικότητα στην περιοχή των 50-60°C και σε τιμές pH μεταξύ 3,5 και 5,0. Αυτή η διαφορά μπορεί να συμβάλει στη βελτιωμένη αποτελεσματικότητα της διαύγασης του χυμού, ειδικά για όξινους χυμούς όπου η σταθερότητα σε χαμηλότερες τιμές pH είναι κρίσιμη. Το μοναδικό χαρακτηριστικό της *P. Σε σύγκριση με άλλες μυκητιακές λακκάσες που έχουν μελετηθεί, η *Pleurotus ostreatus* NRC 620 παρουσιάζει την ικανότητα να λειτουργεί αποτελεσματικά υπό πιο απαιτητικές συνθήκες. Η υψηλότερη βέλτιστη θερμοκρασία δραστικότητάς του υποδηλώνει πιθανά πλεονεκτήματα σε βιομηχανικές εφαρμογές, όπως ταχύτερους ρυθμούς αντίδρασης και μειωμένη μικροβιακή μόλυνση. Το χαμηλό pH του, το οποίο ταιριάζει απόλυτα με την όξινη φύση πολλών χυμών, μπορεί να είναι χρήσιμο σε διαδικασίες διαύγασης χυμών. Αυτά τα αποτελέσματα δικαιολογούν περαιτέρω διερεύνηση για εφαρμογή μεγάλης κλίμακας, καθιστώντας το *Pleurotus ostreatus* NRC 620 μια βιώσιμη εναλλακτική λύση στις παραδοσιακές πηγές λακκάσης από μύκητες. Σε σύγκριση με προηγούμενες μελέτες, διαπιστώσαμε ότι η βέλτιστη θερμοκρασία είναι 60°C και το βέλτιστο pH είναι 3,0. Μετά από αντίδραση στους 60°C για 80 λεπτά, η λακκάση *Ganoderma lucidum* διατηρήθηκε.46% της δραστηριότητάς του.79 Σύμφωνα με τους Kurniawati και Nicelle80Τα ένζυμα *Ganoderma lucidum* παρουσιάζουν εξαιρετική έως μέτρια σταθερότητα στους 25°C και τιμές pH που κυμαίνονται από 5,0 έως 8,0, και σταθερότητα σε pH 6,0 και θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 10 έως 30°C. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το βέλτιστο pH και θερμοκρασία για την ενζυμική δραστικότητα για το *Pleurotus ostreatus* ήταν 3,0 και 70°C, αντίστοιχα. Μετά από επώαση στους 40°C και 50°C για δύο ώρες, το ένζυμο διατήρησε το 68,33% και 59,61% της δραστικότητάς του, αντίστοιχα. Επιπλέον, η λακκάση Pleurotus ostreatus NRC 620 παρουσίασε υψηλή δραστικότητα σε ένα ευρύ φάσμα θερμοκρασιών από 50°C έως 80°C, φτάνοντας σχεδόν στη μέγιστη δραστικότητα (69%–98%), με μέγιστη δραστικότητα να παρατηρείται στους 70°C.
Συμπερασματικά, η λακκάση NRC620 του μανιταριού στρειδιού, που ελήφθη υπό στατικές συνθήκες, επέδειξε βέλτιστη δραστικότητα και σταθερότητα σε ένα εύρος συνθηκών pH και θερμοκρασίας, επιδεικνύοντας ανώτερη σταθερότητα σε σύγκριση με άλλες πηγές ενζύμων. Η προσθήκη 10 mM MgSO₄ και CuSO₄ αύξησε την ενζυμική δραστικότητα κατά περίπου 21% και 35% αντίστοιχα. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε χυμό μήλου, το ένζυμο μείωσε το pH και το ιξώδες, ενώ η φαινολική περιεκτικότητα μειώθηκε μόνο ελαφρώς κατά την αποθήκευση.
Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τις δυνατότητες της λακκάσης στη βιομηχανία τροφίμων, ιδιαίτερα στη διαύγαση ποτών. Διασπώντας ειδικά τις φαινολικές ενώσεις, η λακκάση όχι μόνο μειώνει τη θολότητα και βελτιώνει τη διαύγεια, αλλά διατηρεί επίσης την ποιότητα των χυμών φρούτων υπό ήπιες συνθήκες λειτουργίας. Σε αντίθεση με τα παραδοσιακά διαυγαστικά μέσα όπως η ζελατίνη, ο μπεντονίτης και η σιλικαζέλ, η λακκάση δεν παράγει απόβλητα ούτε αφαιρεί ευχάριστα αρώματα από τα ποτά, καθιστώντας την μια πιο φιλική προς το περιβάλλον και βιώσιμη επιλογή. Επιπλέον, σε σύγκριση με άλλα ένζυμα και μεθόδους διήθησης, η λακκάση προσφέρει μια στοχευμένη και οικονομικά αποδοτική λύση χωρίς να θέτει σε κίνδυνο την ποιότητα του προϊόντος.
Kyomuhimbo, HD και Brink, HG. Εφαρμογές και στρατηγικές ακινητοποίησης λακκασών που περιέχουν χαλκό· ανασκόπηση. Heliyon 9, e13156 (2023).
Ώρα δημοσίευσης: 15 Δεκεμβρίου 2025